IVT（InVitroTranscription）是mRNA生产工艺中的核心环节，优化的IVT体系不仅能提高产量，减少物料消耗，降低生产成本，同时也能确保mRNA的完整性、加帽率及dsRNA杂质的控制，从而降低下游纯化的难度，在整个工艺流程中扮演着关键的保障角色。

IVT反应过程相对简单，标准体系主要包括DNA模板、T7RNA聚合酶（T7RNAP）、NTPs、无机焦磷酸酶、RNase抑制剂及反应缓冲液等组分。DNA模板通常为PCR产物或线性质粒，包含T7启动子、5’UTR、CDS、3’UTR和Poly（A）等功能元素。NTP作为mRNA转录的底物，通过替换为修饰核苷酸以提高mRNA的稳定性和免疫原性。无机焦磷酸酶水解反应中产生的焦磷酸，以提升反应效率，而RNase抑制剂则防止可能的RNase污染。T7RNAP则是反应体系中的关键酶，负责识别DNA模板并将其转录为mRNA。

除了质粒模板的质量外，关键组分T7RNAP和反应缓冲液对IVT效果影响显著。T7RNAP能特异性识别T7启动子，无需额外的蛋白或辅因子即可完成转录，因而成为体外转录中理想的选择。其结构类似于右手，包括N端结构域和C端结构域，结合DNA模板后可催化RNA合成。研究发现，IVT反应中温度对长片段saRNA的完整性有显著影响，随着温度的提高，虽然saRNA的产量增加，但完整性会在超过32℃时迅速下降。

在应对温度对转录影响的同时，瀚海新酶通过荧光信号的激活液滴分选技术（FADS）结合酶定向进化平台，筛选出耐高温、高比活及低dsRNA含量的多种T7RNAP突变体。其中，突变体M16在52℃下展现出显著增强的耐高温性能，转录效率高，且dsRNA含量显著低于传统T7RNAP。针对mRNA的完整性，研究还发现优化反应缓冲液的成分同样至关重要。

优化IVT反应的关键参数包括pH值以及Mg²⁺浓度等。研究显示，大多数RNA聚合酶在接近中性或略偏碱性的环境中活动最佳，而RNA在中性或偏酸性环境中最为稳定。选择合适的缓冲剂和pH值能有效提升IVT产物的质量。此外，Mg²⁺浓度也直接关系到RNA聚合酶的活性，而较高的浓度可能导致非特异性结合和副产物形成。最优化的Mg²⁺浓度使得IVT反应产量达到了显著提升。

最近，有研究表明，使用特定T7RNAP突变体可以显著降低Cap1的使用量，以降低成本，同时保持较高的mRNA加帽率。瀚海新酶通过构建监测体系（STAR），实现了对体外转录活性的实时监控，评估转录效率，并支持与多种修饰核苷酸的兼容性。随着mRNA/saRNA基础平台的持续优化，EVO视讯不断提升反应性能，以实现经济高效的体外转录解决方案。

总之，EVO视讯致力于为客户提供高性能的mRNA疫苗和药物相关的全套材料及解决方案，包括IVT试剂盒、质控试剂盒等服务，通过综合的工艺开发支持，加速客户的新药研发进程。我们欢迎任何关于产品的咨询，期待与合作伙伴共同推动生物医疗领域的发展！